Dr. Noémie JELLY

Développement de microARNs artificiels contre la maladie du court-noué de la vigne.

Soutenue en décembre 2011
Sous la direction de Bernard WALTER et
co-encadré par Paul SCHELLENBAUM et Pascale MAILLOT

La vigne est une espèce pérenne sujette à de nombreuses viroses, entraînant une baisse considérable de rendement et de qualité des fruits. Parmi ces viroses, la maladie du court-noué touche les vignobles du monde entier. Elle est majoritairement causée par le Grapevine fanleaf virus (GFLV). En vue de lutter contre cet agent pathogène, nous avons modifié des précurseurs naturels de microARNs afin d’exprimer des microARNs artificiels (amiRNAs). Ceux-ci devraient induire l’inhibition post-transcriptionnelle de l’ARN du GFLV en recrutant la machinerie des microARNs naturels endogènes et donc réprimer le développement du 
virus.

La transformation génétique de la vigne nécessitant beaucoup de temps, nous utilisons un hôte artificiel herbacé du GFLV : Nicotiana benthamiana. Nous avons ainsi produit plusieurs lignées transgéniques et avons testé l’expression des amiARNs. L’inoculation de ces lignées avec le GFLV-F13 n’a abouti à aucune résistance, et la recherche de mécanismes d’interférence à ARN est en cours. Parallèlement, des essais de transformation transitoire d’embryons somatiques de 
V. vinifera cv. Chardonnay a permis l’expression d’amiRNAs et l’inactivation post-transcriptionnelle de construction GUS-sensors, constituées du gène GUS fusionné avec la séquence ciblée par un amiRNA, démontrant la fonctionnalité biologique de ces amiRNAs chez la vigne, et donc la faisabilité de cette technique.

Jusqu’ici, plusieurs stratégies de résistance dérivée du pathogène ont été testées en vue de lutter contre cette maladie. Cependant, la technique des amiRNAs n’a pas encore été utilisée, et il s’agirait donc du premier rapport concernant le développement d’amiRNAs dirigés contre le GFLV.

Mots clés : virus, court-noué, interférence à ARN, transformation génétique, Vitis vinifera, Nicotiana benthamiana

DEVELOPMENT OF ARTIFICIAL MICRORNAS TARGETING GRAPEVINE FANLEAF VIRUS
Among viral diseases affecting grapevine, the fanleaf degeneration disease, mainly caused by Grapevine fanleaf virus, occurs in vineyards worldwide. So far, several stratagies based on “pathogen- derived resistance” have been used to control this disease. However, the artificial microRNA (amiRNA) technology has never been described in grapevine, and this manuscript is the first report demonstrating the interest of developing amiRNAs targeting GFLV and the feasibility of such a strategy.
We modified an Arabidopsis natural microRNA precursor (ath-pre-miR319a) in order to express amiRNAs targeting GFLV sequences. We tested their ability to induce post-transcriptional silencing of viral RNA by recruiting the natural endogenous microRNA machinery and thus repress viral replication. Nicotiana benthamiana, an artificial herbaceous host of GFLV, was used as a model for transformation and virus inoculation. Several transgenic lines expressing these amiRNAs were produced. Up to now, their inoculation with GFLV did not allow us to detect resistance against the virus 14 days after inoculation, and evidence for an RNA silencing mechanism is currently under investigation. In parallel, transformation assays using somatic embryos of Vitis vinifera cv. Chardonnay allowed the transient expression of amiRNAs and silencing of GUS-sensor constructs, consisting of the GUS gene fused to the amiRNA target sequence, showing evidence for expression and biologicial functionality of these amiRNAs in grapevine.

Keywords: virus, fanleaf degeneration, RNA silencing, genetic transformation, Vitis vinifera, Nicotiana benthamiana